Cell Surface Biotinylace Protocol

Biotinylace využíva schopnosť rozpustný vitamín biotín viazať na bunkové proteíny. Biotín sa viaže na proteín strepavidin a je preto vhodné v bunkovej biológii vizualizovať bunkové proteíny. Biotinylace umožňuje bezpečné značenie proteínov v porovnaní s technikami, ako je rádioaktivity a nemá vplyv na bunky normálnu funkciu. To umožňuje výskumníkom študovať bunkové bielkoviny taký ako receptory, a to umožňuje lepšie pochopiť ochorenia a ochorenia procesov. Označenie pozastavené buniek
bunky

umyť v ľadovo studenej fosfátovým pufrom (PBS) na odstránenie znečisťujúcich látok. Pufre obsahujúce tris a glycín bude súťažiť s biotinylaci a je potrebné sa vyhnúť. Aby sa zabránilo biotinylating vnútorné proteíny, môže byť označenie vykonané na 4 ° C a ° v prítomnosti azidu. Ponorte bunky v PBS a rozpustné biotínu, sulfo-NHS-LC-biotín.
Označenie prívrženec buniek
bunky

umyť v PBS a inkubujú s výrobkom, ako je sulfo -NHS-LC-biotínu. Bunky sa potom škriabal do misky a lyžujú v pufri obsahujúcom detergent Triton-X 100 a pripravené pre vizualizáciu.
Príprava označené bunky

Po inkubácie sa bunky odstredí na pelety a premyté v PBS. Bunky sú resuspendované v PBS a čistenej s gélom IgG Sepharose. Viazaný proteín sa rozpustí v pufri a zahreje na 100 stupňov Celzia.
Vizualizácia buniek

Zriedený bielkoviny možno vizualizovať pomocou hmotnostnej dodecyl sulfátu sodného v polyakrylamidovom géle elektroforézou (SDS- PAGE) a potom blotting s proteínom a Enzyme Mix, streptavidín-chren peroxidu. Škvrny sú zobrazené s chemickou reakciou --- chemiluminiscencie --- ktorý vyžaruje svetlo. Špecifickosť biotinylace môže byť potvrdené s protilátkami pre proteín v rámci štúdie.