Intracelulárne farbenie Protokol pre prietokovej cytometrie

Prietoková cytometrie je nástroj , ktorý je užitočný pri štúdiu bunkových proteínov . Využíva vyžarovanie svetla alebo fluorescencie proteínov v bunke . Protilátky alebo odsávanie štítkovaný ako fluorescencie sa používa k štúdiu špecifických proteínov . Prietoková cytometria sa používa k diagnostike mnohých ochorení , vrátane rakoviny , ale je tiež užitočné pri lekárskom výskume . Upevňovacie bunky
Bunky

by mala byť stanovená pre udržanie stability intracelulárnych proteínov . Počet fixáciu možno použiť ako je napríklad formaldehyd , alebo ľadové acetónu . Po fixácii sa bunková membrána musí byť permealized , aby protilátka pre vstup do bunky . Čistiace prostriedky , ako je Triton , alebo NP - 40 , alebo ľadové metanolu môže byť použitý pre otvory v bunkovej membráne .
Farbenie
bunky

umyte v blokujúceho tlmivého roztoku 0,5 percent bovinná sérový albumín zriedi fosfátovým pufrom , BSA /PBS . Bunky sú inkubované v blokujúcom pufri pre zníženie nešpecifickej väzby . Pridať primárnej protilátky zriedenej v blokujúcom tlmivom roztoku a nechá sa inkubovať pri izbovej teplote , pre optimálnu dobu . Umyť blokujúcim tlmivým roztokom .
Analýza

Inkubujte sekundárnu protilátku , ktorá je označená fluorescenčné značky , pri izbovej teplote po dobu 30 minút . Ak chcete odstrániť bunky neviazaných protilátok umývanie v blokujúcom pufri . Spin bunky na pelety a rozptýľte v PBS a analyzovať na prietokovom cytometri .