Ako merať NADH

NAD a NADH sú oba nukleotidy pyridín podieľajú na metabolizme. NADH a NAD sú čo-enzým v mitochondriách, je powerhouses týchto buniek. Obaja NAD a NADH sa zúčastňuje bunkových reakcií, ako je dýchanie a fotosyntéza, kde sa vytvárajú energia a vodík. NAD a NADH paliva biochemické reakcie, ktoré vyžadujú rad enzýmov k produkcii ATP, hlavný zdroj energie v bunkách. To, čo budete potrebovať
bunky alebo tkanivá pod študijným
NADH Súprava testu
PBS
suchým ľadom
Tepelný blok
96 jamková doštička
Centrifúga popísané
rúrky
doštičiek
Vortex
známy koncentrácie NADH
Zobraziť ďalšie inštrukcie
testu
1

umyte bunky alebo tkanivá pod štúdie s chladnou fosfátu -pufra, PBS. Extrakt buniek alebo rozdeliť tkanivo v extrakčnom pufri tým, že sa zmes na suchom ľade po dobu 20 minút a potom pri izbovej teplote po dobu 10 minút. Opakujte.
2

miešajte 10 sekúnd. Spin v centrifúge po dobu 5 minút do bunky pelety alebo tkanivá nečistoty. Odstráňte supernatant, kvapalná fáza a umiestnite kvapaliny v čistej skúmavky.
3

Filter supernatant prostredníctvom špecializovaného filter pre odstránenie enzýmy, ktoré sa členenie NADH.
4

Odobrať 200 mikro litrov, umiestnite do čistej skúmavky a tepla na 60 stupňov Celzia v termobloku po dobu 30 minút aby došlo k denaturácii NAD. Ochladí sa a odstredí a odstráňte kvapalnú fázu. Prevod 50 mikro l do 96-jamkové doštičky, každá vzorka musí byť v dvoch alebo troch kópiách. Ak chcete zistiť celkové NAD, navyše, nezahrievajte.
5

pripraviť a pridať cyklistické mix na 96-jamkové doštičke. Premiešajte a inkubujte 5 minút. Pridať mikro 10 litrov vývojárov a nechať inkubovať pri izbovej teplote po dobu až 4 hodín. Pridať stop riešenie. Prečítajte si zmenu farby na doske čítačky alebo fluorimeter v závislosti na sade.
Štandardné krivkou a výpočet
6

Pripravte si štandardnú krivku tým, že známy koncentrácie NADH a zriedenie v extrakčnom pufri. Sa zriedi na rôznych koncentráciách, zabezpečenie koncových objem je rovnaký ako skúšobné vzorky. Dosky na rovnakej 96-jamkové doštičky, ako skúšobné vzorky. Odpočítaní OD.
7

remízy štandardná krivka grafu so zameraním na osi X a optickej hustoty na osi y. Vezmite v priemere z každej vzorky a prečítajte koncentrácie z kalibračnej krivky grafu.
8

Spočítajte NAD /NADH pomer odpočítaním celkového NAD, navyše, z NADH a delenie NADH.