Ako si vyrobiť protilátka riedenie pre IHC

imunohistochémia (IHC) je špecializovaná technika, ktorú vedci predstaviť buniek v tkanivách, ktoré boli uvedené na sklíčko a zafarbia vhodným protilátkou, ktorá rozpoznáva proteín, ktorý je jedinečný na bunku alebo tkaniva v prešetrovaní. Protilátok riedenia (titrácia), musí byť vykonávaná za použitia experimentálnych podmienok uvedených v návode k vlastnej protokol, a to, že protilátky výrobcom, pretože dva nemusia byť totožné. Veci, ktoré budete potrebovať
bunky na škvrnu
protilátok
riediacim pufrom ("riedidlo")
Pipety a špičky
mikroskúmavky
Hliníková fólia
laboratórne markery, rúrky a štítky Ľadový
svetlo chránené slide box
Zobraziť ďalšie inštrukcie
1

kontrolu a prípravu protilátky. Skontrolujte, či je protilátka bola zvýšená v správnej hostiteľa, a reaguje s aktuálne verzie proteínu (známy ako izoformy alebo variant zostrihu), ktorý je testovaný. Pomocou pipety, starostlivo sa 10 microliter časť toto a označenie ako "osobné doručenie".

Ak len veľmi malé objemy protilátky sú k dispozícii, tento krok preskočte.

Vedenie osobné zásoby protilátky je rutinná praxou vo všetkých laboratóriách, ktoré zabraňuje krížovej kontaminácii pôvodného genofondu. Rozdeľte to na svetlo chránenej mikroskúmavky, alebo normálne mikroskúmavky, ktorá je zabalená v alobale chrániť pred priamym svetlom.

Uchovávajte trubice na ľade, najlepšie v Esky so vzduchotesným vekom, znovu, aby sa minimalizovalo svetlo, ktoré môže zničiť protilátky. Poznačte pôvodného genofondu je koncentráciou (napr. 100 jednotiek na mililiter, 1 miligram na microliter a tak ďalej) na trubicu, vrátane názvu protilátky a aké, ak vôbec, zmiernili sa riedia (napr. sérum, fyziologický roztok, alebo vody atď).
2

Pripravte Riediaci pufor, tiež známy ako protilátky riedidlá. Skontrolujte, či je to v súlade s protilátkou a imunohistochémia postup sa používa, napríklad, by sa nezakrývajú žiadnu fluorescenciu alebo brániť akejkoľvek následnej sekundárnej protilátky označovanie. Vykonajte štandardné riedenie imunohistochémia (tiež blokujúceho tlmivého roztoku) zmiešaním 1X fosforečnanovým pufrom s 1% Triton-X100, 10% fetálneho teľacieho séra a 0,2% azid sodný.
3

titrovať protilátka. S danou koncentráciu protilátky v osobnom sklade (vyjadrené ako koncentrácia jednotky ako mikrogramov na microliter), stanovenie objemu protilátky potrebné na dosiahnutie 10 mikrogramov protilátky.

Nastaviť sériu riedení pomocou pipety o objeme zodpovedá 2 mikrogramov protilátok (napr. X ul), v 100 mikrolitroch rozpúšťadlá a dôkladne premiešajte napipetovaním hore a dole. Od tohto riedenie s rovnakými X mikrolitrov a dodáva, že k následnému 100 mikrolitrov riedidlá. Tento postup opakujte, kým 8-10 riedenie (alebo seriál) je tvorený.

Posledná trubka bude mať teda najnižšiu koncentráciu a byť "nasýtenia" koncentrácie, ktoré bude generovať najvyššiu úroveň signálu v priebehu experimentu . Avšak, bude ideálna koncentrácia o niečo viac, než je táto koncentrovaná, takže sa vyrába priveľa signálu, čo môže spôsobiť chyby pozadia.

Label rúrky správne s novými zriedených koncentráciách.