Ako na testovanie nukleových kyselín

Testovanie nukleových kyselín sa vykonáva v lekárskej diagnostike, aby bolo možné zistiť, patogény, ako sú vírusy alebo baktérie. Tieto testy sú oveľa rýchlejšie, a preto, aby lekár začať liečbu pacienta, ktorý normálne by musel čakať na potvrdenie infekcie pomocou viacerých zdĺhavé a pracné na báze protilátky testy. Tento proces je tiež známy ako nukleovej kyseliny testu amplifikácie, a zahŕňa metódu známu ako "reverznej transkriptázy zosilnenie" pomocou polymerázovej reťazovej reakcie. Pretože sa jedná o vysoko špecializovaný vedecký postup, pokročilé vedomosti a odborné znalosti v oblasti techniky molekulárnej biológie a teórie je potreba. To, čo budete potrebovať
PCR skúmaviek
PCR termocykléra
pipety a filtra tipy
rukavice
bunky
TRIzolu alebo iné extrakciu RNA PCR činidlá
vyrovnávacej
Taq polymerázu
RT-PCR na 1 mg /ml koncentrácia
RNase-Free Water
dNTP
MgCl2
Náhodné nátery na 1,8 mg /ml, koncentrácia
Superscript II reverznej transkriptázy

Zobraziť ďalšie inštrukcie
spracovanie a príprava RNA
buniek
1

úrodu s činidlom extrakcie RNA, ako TRIzolu. 1 ml, je dostatočné pre zber buniek z jednej i z šiestich-jamkové doštičky pre tkanivové kultúry. Bunky sa dôkladne pipetou hore a dole, a potom homogenizuje vykonať extrakčný postup, ako je popísané v manuáli TRIzolu. Stručne povedané, extrahovať chloroformom a potom sa odstredí oddeliť fázy DNA, bielkoviny a RNA. Obnoviť iba bezfarebný RNA fázy a precipitát, ktorý sa pomocou izopropanolu. Po inkubácii odstrediviek, ktoré a čistiť výsledný pelety s niekoľkými etanolu umýva. Potom resuspendujte pelet v RNase bez vody.
2

reverznej transkripcii, denaturačné presne 5 mikrogramov RNA 65 stupňov Celzia na 10 microliter (ul) objem RNázy voľnej vody, potom rýchlo miesto na ľade. Pre každú reakciu, kombinovať 10 ul RNA, 3 ul 10X PCR reakčného pufra, 2,5 ul 10 milimolární dNTP, 6l 25 milimolární chloridu horečnatého, 1 ul náhodných primérov z 1,8 mg na mililiter koncentráciu, a 0,5 ul horný index II reverznej transkriptázy enzým. Doplňte každú reakciu s 17 ul RNase bez vody. Inkubujte pri izbovej teplote po dobu desiatich minút a potom sa pri 42 stupňoch Celzia po dobu jednej hodiny k vytvoreniu cDNA, potom denaturuje pri 95 ° C a rýchlo sa ľad na zastavenie reakcie.
3

pre polymerázovú reťazovou reakciou, znovu nastaviť reakčnej zmesi v 0,5 ml skúmavkách kombináciou 6 ul cDNA bola dosiahnutá v reakcie reverznej transkripcie, 1,5 ul 10X PCR reakčného pufra, 0,2 mikrolitrov Taq polymerázy, 0,5 mikrolitrov reverzné primer a tiež dopredného primeru, dolejte každej skúmavky s 10,3 ul RNase bez vody. Ak chcete spustiť reakcie, nastaviť termocykléra (tj stroj, ktorý vykonáva polymerázová reťazová reakcia) po dobu 30 cyklov nasledovne: 95 stupňov Celzia po dobu 0,5 minúty na denaturačné, nasleduje 60 stupňov Celzia po dobu 45 sekúnd napojil a konečne 72 stupňov C po dobu 1 minúty rozširujú syntetizovaný prepis.