Molekulárne klonovanie Protokoly

Molekulárne klonovanie protokoly zahŕňajú postupy používané pre definovanie, izoláciu a replikáciu DNA sekvenciu. Tradičné obmedzenia a protokoly vajcovodov klonovanie začať fragmentácii DNA s obmedzenými endonukleázy (enzýmy, ktoré prechádza reťazca DNA v reštrikčných miestach), DNA fragmentu Ligation (oprava nespojitosti v molekulách DNA), je prenos (zavedenie nukleovej kyseliny do buniek tela) a výber (Možnosť výberu jednotlivých genómov pre replikáciu). Izolácia

protokoly pre izoláciu DNA fragmentu, je prvým krokom v molekulárnej klonovanie, často zahŕňať polymerázovej reťazovej reakcie (PMR), ktorý používa cykly vykurovania a chladenia pre zosilnenie časti DNA. Na dosiahnutie cieľa sekvencie veľkosť, iné protokoly obsahujú DNA ultrazvuku, reakcie enzymatické štiepenie a používanie chemických syntetických oligonukleotidov. Tieto protokoly sa líši v závislosti na veľkosti a množstve izolované DNA potrebnej.
Podviaž

Protokoly pre podviazanie zahŕňať použitie enzým, DNA ligázy pripojiť molekuly DNA spolu s kovalentná väzba. Protokol určuje kombinácia fragmentov DNA, klonovanie vektor, ligační vyrovnávacej pamäte na DNA ligázy a sterilizovanej vody na mikroskúmavky a inkubácia cez noc pri teplote 4 stupňov Celzia.
Transfekcia

Protokoly pre transfekciu alebo infúziou DNA do bunky pomocou nevírusových prostriedky, často zahŕňajú vstrekovanie DNA priamo do bunkovej cytoplazmy. Iné metódy zahŕňajú použitie chemických činidiel, ako je napríklad fosforečnan vápenatý a lipidov, dodať transfekcia komplex cez bunkovú membránu. Táto metóda testuje účinky génovej modifikácie na fungovanie špecifických génov.
Výber

výber, alebo skríning, protokoly určiť, ktoré bunky úspešne prebehla DNA vložku a uveďte ktoré bunky potrebujú izoláciu. Centrifugačnej úrody buniek, ktoré obsahujú transfekované DNA, ktoré sa potom inkubuje v lyzozýmu (prirodzene sa vyskytujúce enzým) pufra a liečení zásaditý čistiaci prostriedok, čo proteíny a membrány rozpustnosť. Použitie acetát účelom vyzrážanie proteínov, centrifúgy, tenká filter DNA obsahujúci supernatant (rozpustné kvapalné zostávajúce z odstredením zmesi). Supernatant sa vyzráža polyetylénglykolom, odstredí a suspendovať v cézium chloridu a Etídiumbromid pufra. Sa Etídiumbromid škvrny DNA podľa hustoty, a pomocou dlhovlnné UV svetlo, je nižšia-band DNA extrahovaná s piatimi cc injekčnej striekačky. Rovnovážny stav iónovej výmeny Stĺpec oddelí DNA od Etídiumbromid a cézium chloridu, a konečný DNA peleta sa suspenduje v roztoku pufra a detekované elektroforézou agarózovom géle.