Ako používať GSH úrovne pri detekcii ROS

glutatiónu GSH, alebo je neesenciálna Tripeptid z cysteínu, glutamátu a glycínu. Je to silný antioxidant, ktorý chráni bunky a orgány tela pred škodlivými účinkami ROS alebo reaktívnych kyslíkových radikálov, ktoré vznikajú z molekulárneho kyslíka v dôsledku rôznych metabolických procesov v tele. Antioxidanty, ako je glutatión, neutralizuje voľné kyslíkové radikály zneškodniť a zabrániť im v interakcii s a poškodenia DNA a bielkoviny v bunkách. Pomer oxidované a redukované formy GSH v tele svedčia o ROS súvisiace oxidačného stresu vo vašom tele. Veci, ktoré budete potrebovať
striekačky
motýľ ihly
centrifúgy
heparín sodný
Mraznička
kyselinou sulfosalicylovou
GSH reakcie Agent
Microplate
Svetelný zdroj
GSH štandardný roztok
Zobraziť ďalšie inštrukcie
1

Nakreslite približne 2 ml krvi zo žily na anticubetal žily s 23-gauge butterfly ihlou do 5 ml injekčnej striekačky. Pridať vzorky do skúmaviek obsahujúcich heparín sodný a jemne prevráťte skúmavku miešanie.
2

Zbierajte červené krvinky odstredením vzorky pri 2500 otáčkach za minútu po dobu piatich minút. Zmraziť a rozmraziť vzorku trikrát rozbiť bunky. Odstreďuje bunkového lyzátu roztoku po dobu 10 minút pri 12000 otáčkach za minútu a 4 stupne, a zbierať supernatant.
3

Vyberte proteínu zo vzorky pridaním 5 percent sulfosalicylovou kyseliny a odstredenia vzorka pri 12000 rpm počas doby piatich minút pri teplote 4 °. Skladujte deproteinovaný supernatant -112 stupňov.
4

Mix tiolové detekčné činidlo, GSH reduktázy, nikotinamidadenindinukleotidfosfát a tlmivého roztoku v pomere uvedených výrobcom zostavy, aby GSH reakčnej zmesi. Vyššie každú chemikáliu závisí od počtu testov, ktoré má v úmysle vykonať. Sa zriedi GSH reakčnej zmesi 5 percent kyselinou sulfosalicylovou získať koncentráciu 16, 32, 63, 125, 250 a 500 ul
5

Pridať 1-10 mikrolitrov deproteinovaný krvnej vzorky do jamiek na mikrotitračné doštičky. Pridať riedené GSH štandardné riešenie, ktoré je k dispozícii v testovacej sade, do každej jamky, aby celkový objem každej jamky 10 mikrolitrov.
6

Pridať 90 ul GSH reakčnej zmesi, ktoré ste vykonali v kroku 4 sa do každej jamky v mikrotitračnej doštičky. Zmiešajte činidlo pretrepaním doštičku po dobu 30 sekúnd.
7

Zmerajte absorbanciu okamžite tým, že sa doska pod svetlom s vlnovou dĺžkou 405 a 415 nanometrov. Inkubujte doštičku po dobu 30 minút. Vezmite absorbancie po každých päť minút počas inkubácie.
Fotografia 8

zriedi 6 milimolární spracovaného vzorke s 5 percent kyselinou sulfosalicylovou a trifluromethane sulfonátového riešenie. Tým sa odstránia všetky zníženie GSH z roztoku. Pridať 1-10 micoliters tohto riešenia do jamiek mikrotitračných a zopakujte kroky 5, 6 a 7. To vám pomôže odhadnúť množstvo oxidovaného GSH vo vzorke.
9

Plot absorbancie a koncentrácie vzorky na grafe, aby získal GSH krivky ako znížiť a oxiduje glutatiónu. Vypočíta sa pomer medzi oboma formami GSH. Zvýšené hladiny GSH oxidačné hodnoty sú oxidačný stres a ROS.